细菌基因组 DNA 纯化试剂盒（硅胶膜柱法）

细菌基因组DNA纯化试剂盒（硅胶膜柱法）使用方法：初次使用前请在去蛋白缓冲液和漂洗液中加入无水乙醇，参见瓶身标签或使用说明书。

1，吸取1~2mL对数生长期细菌培养液于1.5mL离心管中。12,000r/min离心1min，尽量吸除上清。
2，对革兰氏阴性菌，向离心得到的菌体沉淀中加入200μL悬浮液，涡旋振荡至充分悬浮。
3，对革兰氏阳性菌，需加入溶菌酶辅助破壁处理。具体方法为：向步骤1中收集的菌体沉淀加入120μL悬浮液，充分悬浮后加入80μL的溶菌酶，37℃水浴30min。如目标菌未知革兰氏属性，按照革兰氏阳性菌提取流程处理。如需要去除RNA，可加入4μLRNaseA（100mg/mL）溶液，震荡混匀后，室温放置5min。
4，加入20μL蛋白酶K，55℃水浴30min。
5，加入220μL裂解液，涡旋振荡混匀，65℃水浴或金属浴10min，溶液形成清亮的悬浮液。裂解液加入后会产生白色沉淀，一般水浴或金属浴后会消失，不会影响后续提取。如溶液未变清亮，说明细菌裂解不彻底，可能导致DNA提取量减少或不纯。如提取菌体超过1.5mL，可适当延长温育时间。
6，加入220μL无水乙醇，振荡混匀，此时可能出现白色絮状沉淀，简短离心将内壁的液体离心到管底。
7，将所得的溶液和絮状沉淀全部加入DNA硅胶膜吸附柱上（吸附柱套入收集管中），12,000r/min离心1min，倒掉滤液，吸附柱套回收集管。溶液中基因组DNA吸附在硅胶膜上，如发生堵塞，说明提取的菌体过量，应适当减少菌量或延长离心时间，直到所有的溶液顺利离心到收集管中为止。
8，加入500μL去蛋白缓冲液，12,000r/min离心1min，倒掉滤液，吸附柱套回收集管。♦去蛋白缓冲液初次使用前加入16mL无水乙醇。
9，加入500μL漂洗液，12,000r/min离心1min，倒掉滤液，吸附柱套回收集管。♦漂洗液初次使用前加入60mL无水乙醇。
10，再次加入500μL漂洗液，12,000r/min离心1min，倒掉滤液，吸附柱套回收集管，再次12,000r/min离心1min，彻底去除吸附柱中残留的液体，室温放置2min，去除残留的乙醇。
11，将吸附柱套入新的1.5mL无菌的离心管中，向吸附柱中央处悬空滴加50~100μL洗脱液，室温静置5min，12,000r/min离心2min，离心得到的液体转移到无菌的EP管中，-20℃保存待用。洗脱液可用无菌去离子水替代，但pH值应在8.0~8.5。将洗脱液预热到60℃使用，可提高基因组DNA得率。为提高基因组DNA提取得率，可将洗脱得到的溶液再次吸出滴加到吸附柱中央，静置几分钟后再次离心收集。